Цодиков Г.В., Зякун А.М., Афонин Б.В., Исаков В.А. и др. Использование изотопной масс-спектрометрии в гастроэнтерологической практике // Альманах клинической медицины, 2006, выпуск № 14, с.143-153.

Авторы: Цодиков Г.В. / Зякун А.М. / Афонин Б.В. / Исаков В.А. / Морозова Н.А. / Ганская Ж.Ю. / Матевосов Д.Ю. / Захарченко В.Н. / Пешенко В.П. / Судовцов В.Е.

Использование изотопной масс-спектрометрии в гастроэнтерологической практике

Г.В. Цодиков, А.М. Зякун, Б.В. Афонин, В.А. Исаков, Н.А. Морозова, Ж.Ю. Ганская, Д.Ю. Матевосов, В.Н. Захарченко, В.П. Пешенко, В.Е. Судовцов

МОНИКИ им. М.Ф. Владимирского,
ИБФМ им. Г.К. Скрябина РАН,
Институт медико-биологических проблем РАН

В механизме развития хронических эрозивно-язвенных изменений гастродуоденальной зоны существенная роль принадлежит бактерии Helicobacter pylori. По данным различных авторов, Нр-инфицированность среди взрослого населения России составляет 70-90%, среди детей школьного возраста – около 30-60%. В связи с этим представляется необходимой диагностика этой инфекции при обследовании практически всех лиц, которые обращаются за медицинской помощью с жалобами на заболевания верхних отделов желудочно-кишечного тракта и в профилактических целях.

В стремлении предупредить ятрогенный путь передачи инфекции всё большее значение приобретают неинвазивные методики, к которым относится и уреазный дыхательный тест (¹³С-УДТ). В его основе лежит масс-спектрометрическая регистрация ¹³СО₂ в выдыхаемом воздухе после приема тестовой мочевины, содержащей повышенное количество стабильного ¹³С изотопа по сравнению с его природной распространенностью (рис. 1).

Рис. 1. Схема уреазного дыхательного теста с ¹³С-мочевиной

Этот тест был впервые применен Грахамом с соавторами в 1987 г. для диагностики хеликобактериоза у человека [12]. При наличии в желудочно-кишечном тракте бактерий Н. pylori, обладающих уникально высокой уреазной активностью, происходит гидролиз мочевины с образованием углекислоты (СО₂) и аммиака (аммония). Образовавшиеся газы всасываются в кровь, затем попадают в легкие и далее с выдыхаемым воздухом выводятся из организма.

Чтобы отличить СО₂, продуцируемый организмом человека как естественный метаболит, от углекислоты, образовавшейся при разрушении мочевины под влиянием бактериальной уреазы, в качестве тест-препарата в организм вводят ¹³С-мочевину, содержащую повышенное количество ¹³С-изотопа по сравнению с его природным содержанием. Если количество ¹³СО₂ превышает его природное содержание в выдыхаемом воздухе, это свидетельствует о наличии уреазной активности в желудочно-кишечном тракте тестируемого пациента. Поскольку в организме здорового человека уреазная активность отсутствует, то это рассматривается как неопровержимое доказательство наличия бактериальной инфекции. В верхних отделах желудочно-кишечного тракта человека, куда в первую очередь поступает водный раствор ¹³С-тест-препарата, представителем микрофлоры, способным расщеплять ¹³С-мочевину, может быть только Н. pylori.

¹³С является нерадиоактивным стабильным изотопом, его природная концентрация в организме человека составляет около 1% от общего количества углерода. Поэтому ¹³С-УДТ, основанный на использовании ¹³С-мочевины как тест-препарата, может применяться широко, в том числе детьми и беременными [5, 7]. В настоящее время во многих медицинских учреждениях мира накоплен большой опыт применения ¹³С-УДТ для выявления Нр-инфекции у человека. Учитывая абсолютную безопасность использования ¹³С-мочевины для человека, в ряде публикаций приведены рекомендации об отсутствии необходимости получения специальных лицензий, разрешающих использование ¹³С-УДТ в медицинской диагностической практике [6].

Существующие методики по реализации ¹³С-УДТ имеют различия в основном по двум направлениям: по способу приема ¹³С тест-препарата и по технологии измерения ¹³СО₂ в выдыхаемом воздухе пациента.

Целью настоящего сообщения является выявление факторов, влияющих на чувствительность и точность регистрации ¹³СО₂ с помощью специализированных физических приборов – масс-спектрометров, а также поиск путей, повышающих эти параметры.

Достоверность и информативность проводимой Нр-диагностики с использованием физических приборов во многом зависит от методики приема ¹³С тест-препарата, схемы отбора проб и анализа содержания ¹³СО₂ в выдыхаемом воздухе.

Во всех сообщениях по технологии тестирования Нр-инфекции с помощью ¹³С-УДТ рекомендуется проводить прием ¹³С-тест-препарата натощак. В ряде методик перед введением через рот водного раствора ¹³С-мочевины за 10-30 мин. предлагается принимать, первичный (пробный) завтрак, состоящий из полужидкой или жидкой пищи: пудинги, соки, свежее молоко или раствор лимонной кислоты [8, 14]. Обнаружено, что максимум выхода ¹³СО₂ с выдыхаемым воздухом у пациента после приема ¹³С-мочевины может зависеть от состава принимаемого предварительного завтрака. Например, использование полужидкой пищи увеличивает время выхода максимума ¹³СО₂ по сравнению с приемом свежего молока или раствора лимонной кислоты. В некоторых сообщениях рекомендуют, чтобы пациент после приема раствора несколько минут находился в лежачем положении и переворачивался с бока на бок. Однако необходимость в выполнении этого требования была подвергнута сомнению, поскольку при специальном обследовании пациентов в лежачем и сидячем положениях существенных различий в выходе ¹³СО₂ с выдыхаемым воздухом по истечении 20 мин. после приема ¹³С-мочевины не обнаружено [12]. Эти примеры свидетельствуют как о недостаточно выясненной роли предварительного питания в диагностике Нр-инфекции, так и о неопределенности в выборе оптимальных условий его приема.

Важным моментом в реализации ¹³С-УДТ является количество тест-препарата (¹³С-мочевины), который используется в диагностике Нр-инфекции, поскольку основную часть стоимости диагностической процедуры составляет стоимость ¹³С-мочевины. В традиционно применяемых методиках количество однократно принимаемой ¹³С-мочевины составляет 75-125 мг. Недавно появилось сообщение о возможности его снижения до 25 мг, благодаря комбинации эндоскопического распыления тестового раствора в желудке [11]. Очевидно, что при этой процедуре теряется главное достоинство ¹³С-УДТ- неинвазивность метода.

Расходы на диагностику Нр-инфекции зависят не только от количества используемого тест-препарата, но и от технологии измерения ¹³СО₂ в выдыхаемом воздухе после приема водного раствора ¹³С-мочевины. Время полного выноса ¹³СО₂ с выдыхаемым воздухом зависит от количества внесенного тест-препарата и уреазной активности, определяемой степенью инфицирования желудочно-кишечного тракта пациента. Оно может составлять от 1,0 до 1,5 часов после приема тестового раствора. Для снижения расходов, связанных с использованием приборного времени, в практике проводят два измерения содержания ¹³СО₂ в выдыхаемом воздухе: до приема тест-препарата и через 30 мин. после его приема. Вопрос о том, насколько такие измерения отражают истинный уровень Нр-инфекции, до последнего времени оставался открытым. Чувствительность и специфичность ¹³С-УДТ в значительной степени зависит от условно выбранного «нулевого» значения количества ¹³СО₂ в выдыхаемом воздухе неинфицированного пациента. В большинстве методических сообщений принимаемая величина «нулевого» значения d¹³C находилась в пределах 2,5-5‰. При ошибке в измерении количества ¹³СО₂ в выдыхаемом воздухе пациента не более 0,2‰ относительно базального уровня величина указанного выше «нулевого» значения является завышенной. Очевидно, что в основе выбора величины «нулевого» значения лежат другие, пока не установленные причины. Таким образом, предельная чувствительность, специфичность ¹³С-УДТ на наличие Нр-инфекции и стоимость анализов зависят от целого ряда недостаточно выясненных факторов.

Задача проведенного исследования заключалась в изучении основных причин, влияющих на чувствительность ¹³С-УДТ и достоверность данных, получаемых с его помощью, а также в выяснении возможных путей снижения затрат, необходимых для использования этого метода.

Обследовано 215 человек, из которых 54 мужчины (в возрасте от 20 до 70 лет) и 43 женщины (в возрасте от 23 до 61 года) жаловались на боли в эпигастрии или изжогу. Для обследуемых пациентов были получены предварительные гастроскопические и микроскопические данные, свидетельствующие о нарушениях состояния слизистой оболочки желудка или двенадцатиперстной кишки (антихеликобактерные препараты не принимались). В число обследуемых входили также 58 человек, прошедших курс антихеликобактерной терапии, и 60 здоровых субъектов. Все участники исследования были проинформированы о целях проводимой работы и дали свое согласие на участие в ней.

Нр-инфекция подтверждена эндоскопическим исследованием с прицельной биопсией слизистой оболочки желудка. Определение наличия бактерий в биопсийном материале проводили общепринятым методом – окраской гистологических препаратов гематоксилином и эозином. С целью верификации Нр-инфекции всем больным до лечения провели дополнительные исследования: микробиологический анализ и полимеразную цепную реакцию на ДНК Н. pylori в биопсийном материале и кале.

Определение уреазной активности проводили с помощью ¹³С-УДТ путем многократной в течение 60 мин. регистрации изотопного состава после приема ¹³С-препарата, что позволило проследить кинетику выделения ¹³СО₂ у обследуемых лиц. Согласно методике настоящего исследования, пациент натощак принимал 20 мг ¹³С-мочевины и 2 г лимонной кислоты, растворенных в 150 мл кипяченой воды. До приема указанного раствора и через 10, 15, 20, 25, 30, 40 и 60 минут пациент в сидячем положении делал спокойный выдох в стеклянную емкость объемом 10 мл, которую затем герметично закрывал резиновой пробкой. Проверка сохранности газа в такой емкости свидетельствовала о возможности ее хранения до нескольких недель без потери информативности.

В качестве тест-препарата использовали ¹³С-мочевину (99% ¹³С, EUROISOTOP Groupe СЕА) и отечественный ¹³С-карбамид-тест (ООО "TSD-ISOTOPES" г. Троицк) фармацевтической квалификации для клинических исследований. В качестве дополнительного питания пациенты принимали два вида пищевой лимонной кислоты: лимонную кислоту (ГОСТ 908-79), поступающую в продажу от продовольственной компании «Второй Дом», Москва (ЛК₁), и лимонную кислоту, поставляемую предприятием РАСПАК, Москва (ЛК₂).

Масс-спектрометрическое измерения изотопного состава углерода выдыхаемой углекислоты проводили на специализированном масс-спектрометре BreathMAT (Finnigan, Германия). Масс-спектрометр соединен с хроматографом, с помощью которого определяется выделение СО₂ в выдыхаемом воздухе. Изменения содержания ¹³С-изотопа в СМ₂ (dC,‰) выявляли согласно выражению

δ¹³C=(R_t/R₀-1)×1000‰,

где R₀ и R_t – отношения содержания ¹³С- и ¹²С-изотопов в СО₂ до и после приема ¹³С-мочевины.

Величина ошибки измерения разности в содержании ¹³С в анализируемой углекислоте относительно лабораторного стандарта не превышало ±0,2‰.

Согласно традиционной технологии диагностики Нр-инфекции с помощью ¹³С-УДТ, перед приемом per os ¹³С-мочевины пациенту давали первичный завтрак, который включал жиры и углеводы [10] или раствор лимонной кислоты [13]. Известно, что изотопный состав углерода пищи и ее компонентов (жиры, белки, углеводы) может варьировать в широких пределах: от -10 до -30‰ [9]. Следовательно, после приема этого завтрака изотопный состав углерода метаболического СО₂ у испытуемого также может варьировать относительно исходного содержания в ней ¹³С в сторону как повышения, так и снижения, в зависимости от того, какой компонент пищи будет метаболизироваться в данный момент. Это может приводить к неконтролируемому изменению изотопного состава углерода выдыхаемой углекислоты в процессе наблюдения и, соответственно, служить источником ложноположительных или ложноотрицательных выводов относительно тестируемой уреазной активности у пациента. Поэтому для получения достоверной информации о возможности гидролиза ¹³С-мочевины в организме обследуемого необходимо было выяснить, в какой степени у пациента может отличаться изотопный состав углерода метаболической углекислоты, которая образуется при использовании компонентов первичного завтрака по сравнению с базальным изотопным составом выдыхаемой углекислоты, определяемым метаболизмом обычно потребляемой пищи.

Учитывая особую значимость этого показателя, на примере обследования 215 жителей Москвы и Московской области был определен базальный диапазон вариаций δ¹³С выдыхаемого СО₂ после 12-часового голодания. Изотопный состав углерода выдыхаемой углекислоты варьировал в пределах δ ¹³С= -(18-26)‰ относительно международного стандарта PDB, а средневзвешенное его значение составляло -22,4‰. Полученный показатель изотопного состава выдыхаемого СО₂ может служить одним из критериев при выборе продуктов для первичного завтрака.

Известно, что цикл мочевины в организме человека сопряжен с циклом трикарбоновых кислот (ЦТК). По имеющимся биохимическим данным в организме взрослого человека за сутки выделяется до 20 г мочевины [3]. Пути вывода мочевины из организма связывают с функцией почек, проводимостью кожного покрова (потовыделение). Основным источником мочевины в желудке является ее выделение из кровотока в просвет желудка. Согласно биохимическим представлениям, прием пищи вызывает активацию ЦТК и, соответственно, цикла мочевины. Очевидно, что реакцией на выделение эндогенной мочевины может быть увеличение активности бактериальной уреазы в случае присутствия Нр-инфекции. В соответствии с этим нами была выбрана в качестве пищевой добавки лимонная кислота как монопродукт, являющийся одним из ключевых звеньев ЦТК.

Изотопный анализ двух образцов пищевой лимонной кислоты, имеющихся в продаже, показал, что в лимонной кислоте от РАСПАК (ЛК₂) содержится больше изотопа ¹³С по сравнению с базальным значением СО₂ для жителей обследованного региона и составляет δ¹³С = -13,4‰. Изотопный состав лимонной кислоты от Второго Дома (ЛК₁), наоборот, имел пониженное содержание изотопа ¹³С по сравнению с базальным значением СО₂ для жителей обследованного региона и составил δ¹³С = -26,4‰.

Изотопный состав углерода в выдыхаемом СО₂ претерпевает изменения после приема натощак 2 г одного из указанных выше образцов лимонной кислоты – ЛК₁ и ЛК₂. Так, после приема водного раствора ЛК₁ изотопный состав углерода выдыхаемой субъектом углекислоты достигал минимума в значении d¹³C примерно через 25 мин. При этом величина разности в изотопном составе углерода в выдыхаемом СО₂ составляла -0,8‰ относительно базального значения. При приеме водного раствора ЛК₂, наоборот, отмечается повышенное содержание ¹³С-изотопа в выдыхаемой углекислоте на 1,3‰, что при определении уреазной активности с использованием ¹³С-УДТ может интерпретироваться как свидетельство наличия Нр-инфекции. Таким образом, результаты проведенного анализа продемонстрировали особую значимость первоначального определения изотопного состава углерода метаболической углекислоты, регистрируемого после приема одного пробного завтрака.

В технологии определения уреазной активности в организме пациента в качестве пищевой добавки в настоящем исследовании использовали лимонную кислоту ЛК₁ с изотопным составом углерода заметно обедненной ¹³С относительно базальной углекислоты. Этот прием позволил регистрировать начало и продолжительность метаболизма экзогенной лимонной кислоты в организме обследуемого субъекта. Изотопный состав тестовой ¹³С-мочевины содержал значительно больше ¹³С по сравнению с ЛК₁. Поэтому на фоне изменения изотопного состава углерода выдыхаемой углекислоты, образующейся при использовании лимонной кислоты, гидролиз ¹³С-мочевины при наличии уреазной активности детектируется с большой степенью достоверности. Значимой величиной, отражающей дополнительное включение изотопа ¹³С в выдыхаемую углекислоту в результате гидролиза тестовой ¹³С-мочевины и указывающей на наличие уреазной активности в организме, является 0,5‰, т.е. увеличение чувствительности метода почти на порядок по сравнению с традиционным анализом. Надежность обнаружения уреазной активности в организме пациентов значительно возрастает в случае регистрации кинетики изменения изотопного состава углерода выдыхаемой углекислоты после одновременного приема водного раствора лимонной кислоты и ¹³С-мочевины.

В качестве демонстрации вышесказанного на рис. 2 приведены результаты измерения изотопного состава углерода выдыхаемой углекислоты после приема ¹³С-мочевины и лимонной кислоты у пациентов с высокой степенью уреазной активности (кривая 1) или с низкой уреазнои активностью (кривая 2), обусловленной Нр-инфекцией, и в норме – при ее отсутствии (кривая 3). В случае детекции Нр-инфекции у пациентов с высокой уреазной активностью достаточно провести измерение в двух временных точках, а именно: до приема тест-раствора и через некоторое время после его приема. Однако при малой уреазной активности для уверенной детекции Нр-инфекции у пациента необходимо провести измерение изотопного состава по нескольким временным точкам, т.е. представить кинетику изменения содержания ¹³СО₂ не менее, чем за 60 минут после приема тест-раствора.

Рис. 2. Кинетика изменения изотопного состава выдыхаемой углекислоты в зависимости от времени наблюдения после приема тестового раствора, содержащего ¹³С-мочевину:
1 – кривая, отражающая ¹³СО₂ при высокой степени инфекции; 2 – кривая, свидетельствующая о следовой активности бактериальной инфекции; 3 – кривая, свидетельствующая об отсутствии хеликобактерной инфекции.

Время максимума выноса ¹³С-углекислоты после приема тест-препарата может зависеть от типа используемого предварительного завтрака. На рис. 3 приведены результаты наблюдения времени максимального выноса ¹³СО₂ у обследованных нами пациентов, в организме которых отмечено наличие уреазной активности. Так, при использовании водного раствора лимонной кислоты в качестве пищевой добавки одновременно с приемом ¹³С-мочевины более чем у 80% обследованных пациентов, инфицированных Нр, время максимума выноса ¹³СО₂ находилось в пределах 15-25 мин. после приема тест-препарата. Лишь у чуть больше 5% пациентов наблюдался максимум выноса ¹³СО₂ в выдыхаемом воздухе через 30 мин. после приема тест-препарата. Из полученных данных следует, что традиционно рекомендованная детекция уреазной активности по содержанию ¹³СО₂ в выдыхаемом воздухе через 30 мин. при наличии Нр-инфекции может неадекватно отражать истинную картину метаболизма ¹³С-мочевины. На основе полученных результатов для скринингового анализа, определяющего хеликобактерную инфекцию, рекомендуем проводить измерения изотопного состава углерода в выдыхаемой углекислоте, по крайней мере, в трех временных точках: а) исходная (до приема тестового раствора), б) через 20 минут после приема тестового раствора и в) через 30 минут (как общепринятое измерение).

Рис. 3. Число обследованных пациентов (%), инфицированных Н. pylori, у которых наблюдался максимум выноса ¹³СО₂ через соответствующий период времени (мин.) после приема тестового раствора, содержащего ¹³С-мочевину.

Для обоснования возможности использования в качестве тест-препарата 20 мг ¹³С-мочевины была проведена оценка максимального значения δ¹³С в выдыхаемой углекислоте. Как следует из рис. 4, примерно у 70% пациентов с Нр-инфекцией после приема тест-препарата изотопный состав углерода выдыхаемой углекислоты в максимуме превышал на 10-30‰ ее базальное значение и лишь у 30% обследованных пациентов отмеченное превышение в изотопном составе находилось в пределах 5-10‰.

Рис. 4. Число пациентов (n в % от всех обследованных ), инфицированных Н. pylori, и зарегистрированное максимальное значение δ¹³С (дельта 13-С, ‰) в выдыхаемой ими углекислоте после приема ¹³С-мочевины.

С учетом ошибки измерения изотопного состава углерода СО₂, составляющей 0,2‰, изотопное отклонение более 5‰ в выдыхаемом СО₂ после приема тест-препарата является вполне значимой величиной. С использованием 20 мг ¹³С-мочевины как тест-препарата проведена корреляция между величиной δ¹³С выдыхаемой СО₂ после приема указанного количества пациентами, имеющими Нр-инфекцию, и количеством Нр-клеток, определенных гистологическим методом. Гистологический метод анализа Нр-бактерий проводили с помощью светового микроскопа после обработки материала биоптата красителями. Определяли степень бактериальной обсемененности по 5 баллам: 0 – в поле зрения (ґ400) клетки отсутствуют; 1 – выявляется 5-10 клеток; 2 – 10-50 клеток; 3 – 50-70 клеток; 4 –более 70 клеток (рис. 5).

Рис. 5. Сравнение данных гистологического (инвазивного) и ¹³С-УДТ (неинвазивного) методов определения хеликобактерной инфекции.

Как следует из приведенных данных, наибольшее расхождение между гистологической оценкой и масс-спектрометрическим анализом отмечено при диагностике малой Нр-обсемененности верхнего отдела слизистой желудочно-кишечного тракта. Очевидно, что это расхождение обусловлено разной информативностью анализируемых проб: гистологические определения ограничены немногими отдельно взятыми пробами (точечный анализ), а масс-спектрометрические данные отражают уреазную активность всей поверхности слизистой желудка и двенадцатиперстной кишки (интегральный анализ).

Таким образом, в диагностике Нр-инфекции с помощью уреазного дыхательного теста использование 20 мг ¹³С-мочевины обеспечивает получение надежных данных об уреазной активности в желудочно-кишечном тракте обследуемого и должно применяться в медицинской практике.

Литература

1. Исаков В.А., Домарадский И.В. Хеликобактериоз. – М., 2003. – 412 с.
2. Лапина Т.Л. // Helicobacter pylori: революция в гастроэнтерологии, под. ред. В.Т. Ивашкина, Ф. Мегро, Т.Л.Лапиной. – М., 1999. – С. 107-116.
3. Мецлер Д. Биохимия. Т. 1-3. – М., 1980. – С. 95-98.
4. Atherton J.C., Washington N., Bleckshaw P.E. et al. // Gut. – 1995. – V. 36. – P. 337-340.
5. Bazzoli F., Zagari M., Fossi S. et al. // Helicobacter. – 1997. – V. 2 (Suppl. 1). – P. 34-37.
6. Bode G., Rothenbacher D., Brenner H., Adter G. // Scand. J. Gastroenterol. – 1998 – V. 33, No. 5. – P. 468-472.
7. Cadranel S., Corvaglia I., Bontems P. // J. Pediatr. Gastroenterol. Nutr. – 1998. – V. 27, No. 3. – P. 275-280.
8. De Niro G., Epstein D. // Science. – 1978. – V. 197. – P. 261-263.
9. Dominguez-Minoz J.E., Leodolter A., Sauerbrach Т., Malferseiner P.A // Gut. – 1997. – V. 40, No. 4. – P. 459-462.
10. Graham D.Y., Klein P.D., Evans D.J. et al. // Lancet. – 1987. – No. 1. – P. 1174-1177.
11. Isomoto H., Inoue K., Shikuwa S.et al. // Eur. J. Gastroenterol. Hepatol. – 2002. – V. 14, No.10. – P. 1093-1100.
12. Miwa H., Murai Т., Ohkura R. et al. // Helicobacter. – 1997. – V. 2, No. 2. – P. 82-85.
13. Reinauer S., Goerz G., Ruzicka T. et al. // Acta Derm. Venerol. (Stockh.) – 1994. – V. 74. – P. 361-363.
14. Wang W.M., Lee S.C., Ding H.J. et al. // J. Gastroenterol. – 1998. – V. 33, No. 3. – P. 330-335.

Назад в раздел